Testování neutralizačních protilátek proti SARS-CoV-2

Datum: 18. 5. 2020

ZÚ se sídlem v Ostravě obdržel povolení SÚJB k nakládání s virem SARS-CoV-2 a zahajuje testování neutralizačních protilátek proti SARS-CoV-2 metodou virusneutralizačního testu. Zavedením tohoto testu rozšiřuje poskytované spektrum vyšetření dosud nabízených sérologických testů ELISA IgG, IgM, IgA. Virologové ze ZÚ v Ostravě mají dlouholeté zkušenosti s virusneutralizačními testy pro různé viry a díky tomu rychle vyvinuli tento test i na SARS-CoV-19.

VNT běžně vyšetřujeme ze vzorku séra či plazmy. Je nejspecifičtějším sérologickým testem a zlatým standardem v detekci specifických protilátek proti virům, proto slouží jako konfirmační test. U sérologické diagnostiky SARS-CoV-2 je jeho role nezastupitelná vzhledem ke značně rozdílné senzitivitě a specificitě komerčních testů ELISA a rychlotestů, které jsou předmětem řady debat v odborných kruzích i veřejnosti.

V současné době, kdy není dosud k dispozici vakcína ani schválená antivirová léčba, je v popředí zájmu léčebné použití konvalescentní plazmy dárců po prodělaném onemocnění COVID-19. Slibné je rovněž profylaktické podání konvalescentní plazmy osobám s rizikem závažného průběhu onemocnění. Podle doporučeného postupu vydaného Evropskou komisí v dubnu 2020 je doporučeno k léčebným účelům používat plazmu dárců s titrem neutralizačních protilátek 320 nebo vyšším (odkaz zveřejněn na webu SÚKL).   http://www.sukl.cz/zdravotnicka-zarizeni/doporuceny-postup-pro-vyrobu-a-uziti-covid-19-konvalescentni

Tento titr lze stanovit pouze virusneutralizačním testem. Podle zveřejněných protokolů by měli být příjemci konvalescentní plazmy monitorování měřením titrů neutralizačních protilátek před zahájením jejího podání i v dalším průběhu léčby.

Dalším využitím VNT je stanovení hladiny neutralizačních protilátek v populaci pro zjištění stavu promořenosti nebo monitorování protilátek u osob po prodělaném onemocnění COVID-19 ke zjištění doby trvání jejich ochranného účinku. Metoda VNT má vyšší specificitu i citlivost než rychlotesty použité k těmto účelům nebo ELISA testy. Lze předpokládat, že u některých osob po prodělané infekci SARS-CoV-2 nebyly protilátky v rychlotestech detekovány pro jejich nízkou citlivost, naopak jiní měli výsledky falešně pozitivní. Testem VNT by byly zachyceny osoby, které skutečně infekci prodělaly.

Ideálně VNT kombinujeme s pečlivě vybranou metodou ELISA, která umožňuje rozlišit jednotlivé třídy protilátek (IgG, IgM, IgA). Nevýhodou metody VNT je její delší trvání (5-7 dní), neboť se jedná o biologický pokus s využitím živého viru a vnímavých buněk. Metoda VNT nerozliší třídy protilátek, ale zachytí pouze ty protilátky, které mají neutralizační (ochranný) účinek.

Na obrázku je mikrotitrační destička, na které je vyšetřeno 8 vzorků sér metodou VNT (na každém řádku je jeden vzorek v postupném ředění 1:10 až 1: 2560). Červeného zbarvení je docíleno použitím speciálního barviva, které je absorbováno do cytoplazmy živých buněk nepoškozených virem. Séra pacientů obsahující neutralizační protilátky ochrání buňky před infekcí virem SARS-CoV-2, které zůstávají živé i v jeho přítomnosti a příslušné jamky se zbarví červeně. Jamky se vzorky, které neobsahují neutralizační protilátky, zůstávají bezbarvé, protože přítomný virus buňky infikoval a usmrtil. Do prvních 3 jamek každého řádku se nepřidává virus, slouží k ověření životaschopnosti buněk pouze za přítomnosti vyšetřovaného vzorku, proto by měly vždy být červeně zbarvené.

Testování neutralizačních protilátek proti SARS-CoV-2 metodou virusneutralizačního testu

První výsledky získané na souboru pacientů po prodělaném onemocnění COVID-19 a negativních kontrolách potvrzují jeho vysokou specificitu i senzitivitu. Všechny vzorky s pozitivním výsledkem VNT pocházely od pacientů s PCR potvrzenou prodělanou infekcí SARS-CoV-2, zatímco VNT negativní vzorky pocházely od pacientů, u nichž SARS-CoV-2 infekce nebyla potvrzena.

Ve srovnání s VNT vykazovaly rychlotesty i komerční ELISA testy nižší specificitu i senzitivitu. VNT nerozlišuje třídy protilátek, proto ani u RT a ELISA testů nebyly v porovnání rozlišeny třídy protilátek. Za pozitivní je považován vzorek s pozitivitou alespoň v jedné třídě testovaných protilátek, za negativní jsou považovány vzorky s negativními výsledky ve všech třídách protilátek.

Rychlotesty měly ve srovnání s VNT senzitivitu v rozmezí 55-73%, specificitu 75-100%. ELISA testy měly ve srovnání s VNT senzitivitu 82% a 89%, specificitu 50% a 85%.

Vzhledem k malému počtu vyšetřených vzorků, zejména v rychlotestech, však nelze jednoznačně stanovit charakteristiku testů, výsledky jsou tedy jen orientační.

 

Rychlotesty (RT) – 4 výrobci
  počet vzorků
VNT pozit.
počet vzorků
RT pozit.
(senzitivita %)
počet vzorků
VNT negat.
počet vzorků
RT negat.
(specificita %)
RT 1 (B) 11 8 (73%) 4 3 (75%)
RT 2 (N) 11 6 (55%) 4 4 (100%)
RT 3 (E) 22 16 (73%) 7 6 (86%)
RT 4 (I) 20 11 (55%) 4 4 (100%)

 

ELISA – 2 výrobci
  počet vzorků
VNT pozit.
počet vzorků
ELISA pozit.
(senzitivita %)
počet vzorků
VNT negat.
počet vzorků
ELISA negat.
(specificita %)
ELISA 1 (E) 38 34 (89%) 20 17 (85%)
ELISA 2 (N) 34 28 (82%) 18 9 (50%)

MUDr. Hana Zelená, Ph.D.
vedoucí oddělení virologie CKL ZÚ se sídlem v Ostravě

Aktuality

 
Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě
Partyzánské náměstí 2633/7, Moravská Ostrava, 702 00 Ostrava,
tel.: 596 200 111, fax: 596 118 661, podatelna@zuova.cz,
Datová schránka: pubj9r8